下面讓我們一起來(lái)了解一下腺苷酸環(huán)化酶的電鏡酶細(xì)胞化學(xué)試驗(yàn)方法

　　腺苷酸環(huán)化酶主要分布于細(xì)胞質(zhì)膜、核膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。它也是一種磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'-環(huán)磷酸腺苷(cAMP)并釋放出焦磷酸。

　　Howell等人(1972)首先用亞胺二磷酸腺苷(AMP-PNP)作底物，成功地對(duì)動(dòng)物細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶進(jìn)行了定位。現(xiàn)已確認(rèn)，在未固定和固定的組織中，ATP-PNP是腺苷酸環(huán)化酶的專(zhuān)一性底物，在腺苷酸環(huán)化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，后者與捕捉鉛離子反應(yīng)，生成一種不溶性的電子密度很高的產(chǎn)物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性，為克服這一缺點(diǎn)， Fujiomto等(1981)設(shè)計(jì)了使用二鉀亞砜(DMSO)的*法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的*法。

　　固定:配制固定液的緩沖液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩沖液，內(nèi)含8%蔗糖、5%的DMSO。

　　固定液配方: 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對(duì)于肝臟來(lái)說(shuō)，1%以上的戊二醛固定時(shí)，可導(dǎo)致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能較好保存。總體來(lái)說(shuō)，多聚甲醛與戊二醛的濃度應(yīng)因組織而異。一般在0~4℃固定2小時(shí)或室溫固定1小時(shí)。

　　洗滌:用配制固定液相同的緩沖液漂洗1小時(shí)~過(guò)夜，期間更換緩沖液數(shù)次;而后進(jìn)行厚切片;

　　孵育:配方及條件見(jiàn)\ref,

　　作為腺苷酸環(huán)化酶特異底物的AMP-PNP在室溫中或長(zhǎng)期冷凍保存時(shí)，ATP、AMP-PN 和AMP-PNP-P等化合物容易增多，應(yīng)引起注意。左旋咪唑的加入是由于底物AMP-PNP 容易受到組織的堿性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制該酶的活性，在堿性磷酸酶活性高的組織內(nèi)，左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環(huán)化酶的激活劑，應(yīng)根據(jù)組織不同進(jìn)行前處理后，將氟化鈉加入到孵育液中。

　　后固定:后固定前，必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩沖液進(jìn)行充分洗滌。

　　殘存的DMSO可以與鋨酸反應(yīng)，產(chǎn)生擴(kuò)散性的微細(xì)顆粒。后固定用二甲胂酸鈉緩沖液配制的1%~2%的鋨酸。鋨酸后固定時(shí)對(duì)酶反應(yīng)產(chǎn)物有一定的影響，有人認(rèn)為固定時(shí)間不應(yīng)超過(guò)10min，超過(guò)后可引起酶反應(yīng)產(chǎn)物顆粒變粗變大、擴(kuò)散，有時(shí)由于全部溶出而導(dǎo)致*沒(méi)有反應(yīng)產(chǎn)物的陰性結(jié)果。因此認(rèn)為用鋨酸固定時(shí)間最好控制在5分鐘內(nèi)。也有用2~4%的戊二醛代替鋨酸進(jìn)行后固定。

　　對(duì)照實(shí)驗(yàn)中可除去底物AMP-PNP，也可在對(duì)照實(shí)驗(yàn)的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。